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簡體中文世界首例無豬內源性反轉錄病毒（PERV）傳染性的
近交系小型豬新品系
在 2017 年 6 月 23 日第八屆北京實驗動物科學國際論壇上，軍事醫學科學院章金剛研究員向大會做了題為“五指山近交系內源性反轉錄病毒（PERV）及無 PERV 傳染性新種群建立研究”的報告，宣布我國科學家在世界上首次通過遺傳選育的方式獲得無 PERV 傳染性的近交系小型豬。
豬是異種器官移植的最佳供體。而用于人的豬源異種器官移植兩大障礙之一，是豬內源性反轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus, PERV）的潛在感染風險。PERV 是一種以前病毒 DNA 形式整合入豬基因組中的反轉錄病毒，由 PERV-gag、pol、env 三基因組成，可隨細胞基因組的復制而復制。部分豬源細胞可釋放 PERV 病毒顆粒，并能感染多種體外培養的人源細胞。因此，消除 PERV 的潛在跨物種感染風險，是異種器官移植的必要安全考慮。
解決 PERV 風險的途徑有兩種。一種是通過基因修飾技術去除豬體內 PERV 基因。代表成果是哈佛醫學院遺傳學教授喬治·丘奇和楊璐菡博士團隊，利用新的基因編輯技術 CRISPR/Cas9，一次性的敲除了隱藏在豬基因組中的 62 個 PERV-pol 基因片段，體外實驗驗證病毒的感染率被削弱了近 1000 倍，結果發表在 2015 年 10 月《Science》雜志。同年，該團隊聯合創立了美國 eGenesis 生物技術公司，專注于將基于基因編輯的異種移植技術運用到臨床醫療程序中。近日有報道稱，eGenesis 公司經過多基因修飾的 PERV 陰性豬即將出生。與此同時，我國多家科研團隊也在嘗試采用基因編輯方法培育 PERV 陰性豬，并先后取得各種階段性進展。
排除 PERV 病毒潛在感染風險的另一種途徑，則是選育無 PERV 感染風險的豬。軍事醫學科學院的章金剛研究員、馬玉媛副研究員聯合蓋蘭德生物科技首席科學家馮書堂教授，另辟蹊徑，在世界上首次采用遺傳篩選的方法，經過細胞共培養，采用 PCR、RT-PCR、反轉錄酶活性檢測等方法進行鑒定，通過初篩與確證實驗，參照美國 FDA 的標準，在五指山小型豬近交系中篩選出無 PERV 傳染性的近交系小型豬個體。經初步遺傳分析，所有篩選出的無 PERV 傳染性個體之間存在一定的遺傳規律。在這一重大發現基礎上，研究人員正在對篩選出的無 PERV 傳染性個體進行全基因組重測序分析，現已證實其中 1 個個體為 PERV-pol 基因缺陷型。至此，研究團隊不僅第一次在國際上篩選出了無 PERV 病毒傳染性近交系豬，而且從基因水平上驗證了 PERV 病毒無傳染性的原理。上述研究成果已申請國家發明專利兩項，并即將在國際期刊雜志上發表論文。
研究團隊認為，無 PERV 傳染性的小型豬近交系的選育成功，主要原因是五指山小型豬近交系經過長達 28 年的近交培育，已普遍具有 PERV 病毒 A、B 型弱、拷貝數少、無 C 型病毒的遺傳特征，近交種群出現病毒感染性發生變異的個體。蓋蘭德生物科技有限公司正利用篩選出的無 PERV 傳染性近交系豬群體培育新品系，父母均為無 PERV 傳染性近交系豬的 F1 已于 2017 年 5 月底出生，研究團隊將持續對其進行無 PERV 傳染性的監測，未來有望進一步揭示 PERV 病毒 pol 基因缺陷型豬的遺傳原理。相比較基因修飾的方法，近交系篩選的無病毒傳染性豬，具有更可靠的病毒安全性，避免多種基因修飾對豬健康生長的潛在威脅，且可以大規模繁育，為批量生產安全標準的豬器官、組織與材料提供了保障
豬是異種器官移植的最佳供體。而用于人的豬源異種器官移植兩大障礙之一，是豬內源性反轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus, PERV）的潛在感染風險。PERV 是一種以前病毒 DNA 形式整合入豬基因組中的反轉錄病毒，由 PERV-gag、pol、env 三基因組成，可隨細胞基因組的復制而復制。部分豬源細胞可釋放 PERV 病毒顆粒，并能感染多種體外培養的人源細胞。因此，消除 PERV 的潛在跨物種感染風險，是異種器官移植的必要安全考慮。
解決 PERV 風險的途徑有兩種。一種是通過基因修飾技術去除豬體內 PERV 基因。代表成果是哈佛醫學院遺傳學教授喬治·丘奇和楊璐菡博士團隊，利用新的基因編輯技術 CRISPR/Cas9，一次性的敲除了隱藏在豬基因組中的 62 個 PERV-pol 基因片段，體外實驗驗證病毒的感染率被削弱了近 1000 倍，結果發表在 2015 年 10 月《Science》雜志。同年，該團隊聯合創立了美國 eGenesis 生物技術公司，專注于將基于基因編輯的異種移植技術運用到臨床醫療程序中。近日有報道稱，eGenesis 公司經過多基因修飾的 PERV 陰性豬即將出生。與此同時，我國多家科研團隊也在嘗試采用基因編輯方法培育 PERV 陰性豬，并先后取得各種階段性進展。
排除 PERV 病毒潛在感染風險的另一種途徑，則是選育無 PERV 感染風險的豬。軍事醫學科學院的章金剛研究員、馬玉媛副研究員聯合蓋蘭德生物科技首席科學家馮書堂教授，另辟蹊徑，在世界上首次采用遺傳篩選的方法，經過細胞共培養，采用 PCR、RT-PCR、反轉錄酶活性檢測等方法進行鑒定，通過初篩與確證實驗，參照美國 FDA 的標準，在五指山小型豬近交系中篩選出無 PERV 傳染性的近交系小型豬個體。經初步遺傳分析，所有篩選出的無 PERV 傳染性個體之間存在一定的遺傳規律。在這一重大發現基礎上，研究人員正在對篩選出的無 PERV 傳染性個體進行全基因組重測序分析，現已證實其中 1 個個體為 PERV-pol 基因缺陷型。至此，研究團隊不僅第一次在國際上篩選出了無 PERV 病毒傳染性近交系豬，而且從基因水平上驗證了 PERV 病毒無傳染性的原理。上述研究成果已申請國家發明專利兩項，并即將在國際期刊雜志上發表論文。
研究團隊認為，無 PERV 傳染性的小型豬近交系的選育成功，主要原因是五指山小型豬近交系經過長達 28 年的近交培育，已普遍具有 PERV 病毒 A、B 型弱、拷貝數少、無 C 型病毒的遺傳特征，近交種群出現病毒感染性發生變異的個體。蓋蘭德生物科技有限公司正利用篩選出的無 PERV 傳染性近交系豬群體培育新品系，父母均為無 PERV 傳染性近交系豬的 F1 已于 2017 年 5 月底出生，研究團隊將持續對其進行無 PERV 傳染性的監測，未來有望進一步揭示 PERV 病毒 pol 基因缺陷型豬的遺傳原理。相比較基因修飾的方法，近交系篩選的無病毒傳染性豬，具有更可靠的病毒安全性，避免多種基因修飾對豬健康生長的潛在威脅，且可以大規模繁育，為批量生產安全標準的豬器官、組織與材料提供了保障
五指山小型豬近交系
??? 實驗動物是生命科學研究和生物醫藥研發不可或缺的基礎條件之一。生物醫藥科研及開發項目投資的40%-60%涉及實驗動物，目前應用最廣的實驗動物是近交系鼠類。大型實驗動物中，小型豬在形態學、解剖學、生理學等方面比其他動物種類更接近人類，且因倫理、繁育、成本及操作等優勢，在實驗動物中獲得越來越多的關注。然而與近交鼠類相比，一直缺乏近交系是影響大型實驗動物應用價值的一大障礙。
五指山小型豬近交系
作為新物種的五指山小型豬近交系：實驗動物與異種移植的新境界
??? 五指山小型豬近交系具有體型小、性成熟早、繁殖率較高、不含應激反應基因、內源性逆轉錄病毒拷貝少、免疫代謝、心血管疾病等基因與人類有較高同源性等特點。該近交系經歷20代以上近親繁育，基因型高度純合，少數基因在近交系群體中雜合度為一，其毛色、體型等遺傳表型穩定，解剖生理等生物性狀均一，個體差異極小，便于飼養管理，適于規?；?、標準化生產。經與70余家科研與醫療機構合作研究證明，五指山小型豬近交系作為實驗動物具有靈敏度高、可靠性強和可重復性好等特點，符合生物醫藥研究與開發的各類要求，可節約大量的人力、物力及財力。同時，小型豬近交系具有便于基因修飾和改造的優勢，是異種組織與器官移植研究與產品開發的最佳載體。綜合在生命科學及其其他領域的潛在價值，小型豬近交系有望成為生物醫藥產業的新型支柱性資源。
五指山小型豬近交系的科學性、先進性和唯一性
???? 1．參照并改進近交系鼠類經典的異體皮膚移植鑒定方法，由中國人民解放軍總醫院（301醫院）全軍創傷燒傷重點實驗室設計并完成“五指山小型豬近交系異體皮膚移植鑒定試驗，2013年發表成果顯示該近交系豬個體間未發現免疫排異反應，證明其個體間免疫細胞具有同種抗原、基因高度純合，從而確證該近交系育成。該研究同時創建了小型豬近交系的鑒定方法和標準，也為大型哺乳動物近交系提供了系統的鑒定方法和標準。
????? 2.? 五指山小型豬近交系的全基因組序列分析與鑒定于2012年由華大基因完成，該項研究發現全基因組2.5GB，共注釋出20,326個基因，其中有18,000個基因和人等近源物種有同源關系，與人類的平均蛋白相似度達到85%以上；該近交系全基因組純合度高達60%，近似近交系小鼠（非近交系動物僅達到8-11%），進一步證明該近交系研發成功。該研究還發現近交系小型豬的內源性逆轉錄病毒（PERV）A、B型拷貝數較少，且不存在C型拷貝（軍科院、華大基因組提供）。與人類心血管疾病相關基因對比，小型豬近交系僅缺少了ARMS2和CETP，其余245個基因和人的相似度約為85%。已發現人類1624藥物靶基因中，該近交系有1618個與人類同源（鼠、獼猴只有1616個）。此結果從基因水平上驗證了五指山小型豬近交系是理想的實驗動物模型，具有作為人類“替難者”的完整功能和廣泛價值。
????? 3.? 利用Illumina公司研發的豬高密度SNP芯片（6萬個SNPs），對該近交家系中的F17至F226個世代共96個樣品的基因型進行了系統測定，并與非近交系五指山豬進行比對分析。發現分布于近交系 18對常染色體上的50,418個有效SNPs中，F20 SNPs已被固定的比例高達80.0%以上, 而非近交系五指山豬的所有染色體區域均表現高度雜合，50,418個有效SNPs彌漫性、均勻性、無規律的分布18個染色體。6個世代96個樣本X染色體基因組的1095個SNPs位點中，雖有182個位點具有一定的多態性，但基因組純合區高達83.4%，而16個海南五指山豬樣本幾乎無一純合，這一結果說明兩者遺傳基礎已經完全不同。48 頭WZSP近交系（F20-F22）個體7號染色體上與MHC 免疫相關的13個基因中，F22個體全部純合，F20和F21僅有一個基因雜合，而對照組無一純合，該結果不但為其異體皮膚移植不發生免疫排斥反應提供了依據，而且在分子遺傳學的層面上，再次證明一種新的遺傳資源誕生。
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